تاریخچه ی:
مهندسی ژنتیک در مخمرها
||مهندسی ژنتیک شامل تکنیکهایی است که با جدا کردن ژنهای خاص و انتقال آن به ناقلین مخصوص و تظاهر ژن در یک میزبان ، باعث بروز یک صفت خاص یا محصول مورد نظر میشود. مخمرها موجودات یوکاریوتی هستند که دارای یک ((پلاسمید)) میباشند و بنابراین به عنوان ناقل در تکنیکهای مهندسی ژنتیک شرکت میکنند.||
!دید کلی
سلولهای باکتری مانند E. Coli به هیچ وجه تنها سلول میزبان مهندسی ژنتیک نیستند. مخمرها موجودات یوکاریوتی هستند که بخصوص برای اینکار مناسب میباشند. همانند باکتری اشرشیاکلی ، ژنتیک مخمر به خوبی شناخته شده است. ((ژنوم|ژنومی)) که بیشتر مورد استفاده قرار میگیرد __Saccharomyces Cerevisae__ میباشد که تنها دارای {TEX()} {14X10^6} {TEX} جفت باز بوده که ژنوم ساده است و اندازه آن 4 برابر ((کروموزوم)) E.Coli است. و توالی آن به خوبی شناخته شده است. مخمر میکرو ارگانیزمی است که به سادگی نگهداری شده و در مقیاس بزرگ در آزمایشگاه قابل تکثیر است.
بسیاری از پروتئینهای یوکاریوتی بعد از ترجمه توسط آنزیمهایی تغییر داده میشوند که در باکتریها وجود ندارند، هم اکنون روشهای مناسبی برای ورود و خروج ''__DNA__'' به داخل و خارج سلولهای مخمری وجود دارد که مطالعه بسیاری از ویژگیهای بیوشیمیایی سلول یوکاریوتی را راحت میکند. با قرار دادن ''__DNA__'' کلون شده در داخل پلاسمیدی که در مخمر قادر به همانند سازی است. میتوان کارآیی ترانسفورماسیون را افزایش داد. با ایجاد تغییرات مهندسی ، پلاسمید 2 میکرونی طبیعی مخمر را میتوان به انوع مختلف از ناقلین کلون سازی تبدیل کرد که دارای یک مبدا همانند سازی و سایر توالیهای مورد نیاز برای حفظ پلاسمید در مخمر باشند.
!پلاسمید در مخمر
اکثر سوشهای مخمر دارای یک حلقه ''__DNA__'' هستند که بطور مستقل و خود به خود همانند سازی و حلقه 2 میکرونی نام دارد. این پلاسمید مخمری در حدود 6300 جفت باز دارد که تعداد کپی آن به 50 کپی در نوکلئوپلاسم (فضای درونی هسته) میرسد. تقسیم این پلاسمیدها وابسته به کروموزوم مخمر نمیباشد و احتمالا پروتئینهای لازم برای همانند سازی را خود کد میکنند.
!جذب ''__DNA__'' خارجی در اسفروپلاستهای مخمر
''__DNA__'' به راحتی میتواند وارد ~~green:اسفروپلاست مخمر~~ شود. دیواره مخمر از جنس سلولز است، با حذف دیواره سلول مخمر توسط آنزیم ، بخش باقیمانده اسفروپلاست نامیده میشود. سپس افروپلاستها در معرض CaCl2 و ''__DNA__'' و یک پلیالکل به نام ((اتیلن گلیکول|پلیاتیلن گلیکول)) قرار میگیرند، این پلیالکل غشاء را نفوذپذیر کرده و اجازه ورود ''__DNA__'' را به داخل میدهد. اسفروپلاستها در محیط بازیافت قرار میگیرند و دیواره آنها مجددا ساخته میشود و تبدیل به یک سلول کامل مخمر میشوند.
!ادغام ''__DNA__'' خارجی به درون کروموزوم مخمر
''__DNA__'' انتقال یافته به اسفروپلاست مخمری در توالیهای همسان میتواند در درون کروموزوم ادغام شود. اگر ''__DNA__'' وارد شده حلقوی باشد، ادغام آن با کروزموزوم بسیار نادر است. حتی اگر نواحی همسان با توالی کروموزوم وجود داشته باشد. ولی اگر پلاسمید توسط یک ((آنزیم)) محدود الاثر (Restriction) بریده شود و سپس به درون اسفروپلاست مخمری وارد شود، امکان ورود پلاسمید به کروموزوم افزایش مییابد. از تکنیک ورود به کروموزوم اسفروپلاست مخمر جهت تعویض یکی از آللهای ژن آکتین مخمر استفاده شده است.
!انواع وکتورها یا حاملهای مخمر
!!پلاسمیدهای انتگراتیو (Yeast Integrative Plasmid)
این دسته پلاسمیدها از سادهترین ~~green:وکتورها~~ در مخمر هستند. دارای ژنهای انتخابی مخمر هستند ولی فاقد توالیهای مخصوص شروع همانند سازی توسط خود پلاسمید میباشند. این حامل توالی از یک پلاسمید باکتریایی را حمل میکند که یک مبدا همانند سازی و یک ژن مقاومت به دارو را برای آن فراهم می کند تا رشد در باکتری اشرشیاکلی (E.Coli) صورت گیرد. در ضمن یک ژن مارکر برای انتخاب مخمرهای ترانسفورمه شده و نیز مکانهای خاصی برای نفوذ یک توالی جدید داراست. خطی کردن یک پلاسمید قبل از ترانسفورماسیون سبب نفوذ آن به یک جایگاه خاص از کروموزوم می شود.
!!پلاسمیدهای قابل همانند سازی
این پلاسمیدها به صورت حلقههای پلاسمید آزاد در مخمر وجود دارند. یکی از انواع آنها از مبدا همانند سازی یک پلاسمید طبیعی مخمر (پلاسمید 2 میکرونی) استفاده میکند. بقیه مبدا ((همانند سازی ژنتیکی|همانند سازی سلولی)) را به نام توالی همانند سازی مستقل بکار میبرند. یک گروه از پلاسمیدهای حلقوی قابل همانند سازی به نام (yeast Episomal Plasmid) است، که توالیهایی از پلاسمید طبیعی مخمر را دارا میباشند. این توالیها اجزاه همانند سازی خارج کروموزومی را میدهند، فرکانس ترانسفورماسیون را تا حد 104 - 105 در کیلوباز ''__DNA__'' افزایش میدهند. این پلاسمیدها برای بیان __ژن__ در سطح بالا استفاده میشوند.
!!کروزموزوم ساختگی مخمر
این نوع ((کروموزوم)) شامل یک سانترومر و دو تلومر در دو انتهای کروموزوم هستند که کارشان پایداری انتهای کروزموزوم است و سبب میشود این کروموزوم به صورت کروموزومهای خطی کوچک ، همانند سازی شود. این کروموزوم میتواند چند هزار جفت باز ''__DNA__'' را حمل کند که البته پایداری کمتری از کروموزوم مخمر دارد، تعداد نسخه اینها در هر سلول یک عدد است.
!کلون کردن ژنهای مخمر
بر اساس قابلیت یک ~~green:ژن~~ میتوان آن را بطور مستقیم در مخمر کلون کرد. این روش تحت عنوان مکمل سازی ژنتیکی است که نمونه آن استفاده از ~~green:مارکر~~ (LEUZ) میباشد. در این حالت کروموزوم مخمر را قطعه قطعه کرده و همراه با این ژن مارکر (نشانگر) وارد باکتری اشرشیاکلی فاقد ژن لوسین میکنند. اشرشیاکلی که در محیط فاقد لوسین رشد کند ژن مارکر مخمر و قسمتی از کروموزوم مخمر را دریافت میکند. پلاسمید را نیز میتوان داخل مخمر کلون کرد.
نمونهای از این کلون کردن با استفاده از موتان مخمر حساس به حرارت است که در حرارت مجاز رشد میکند، ولی در حرارت غیر مجاز قادر به رشد نیست. فنوتیپهای حساس به حرارت معمولا در اثر موتاسیون در ژن کد کننده یک پروتئین غیر فعال در حرارت بالا صورت میگیرد، بوجود میآیند. ژن تیپ وحشی در موتان حساس به حرارت که تخریب شده به آسانی به وسیله مکمل سازی ژنتیکی میتواند در مخمر کلون شود.
!تهیه واکسن توسط کلون کردن ژن مربوطه به مخمر
*تولید واکسن بر ضد ((بیماریهای عفونی)) یکی از موفقیتهای مهم در پزشکی میباشد. قبل از وقوع تکنولوژی ''__DNA__'' نوترکیب ، دو نوع از واکسنها استفاده میشوند. یک سری واکسنهای غیر زنده و یک سری واکسنهای ضعیف شده. هر دو نوع واکسن با در دسترس بودن پروتئینهای سطحی برای لنفوسیتهای B و T عمل میکنند و هنگام ورود عامل عفونی به بدن قبل از اینکه هر گونه آسیبی بزنند توسط عوامل ایمنیزای موجود در بدن از بین میروند.
*به هر حال این نوع واکسنها به دلیل امکان آلوده بودن با ارگانیزم عفونی خطرناک هستند. مثلا ابتلا به پولیو در بعضی کودکانی که واکسن آن را دریافت کردهاند. بنابراین یکی از کابردهای مهم تکنولوژی ''__DNA__'' نوترکیب تولید زیر ساختمانهای واکسن است، که به این شکل دیگر خطر ابتلا به عفونت در حین دریافت واکسن وجود ندارد.
*اولین واکسن تولید شده به روش استفاده از ''__DNA__'' نوترکیب ، ((هپاتیت B)) بود که عامل ((عفونت کبد)) و تخریب آن است و در بعضی موارد منجر به ((سرطان کبد)) میشود. ویروس فوق با یک ((آنتی ژن|آنتی ژن سطحی)) به نام (HBSAg) پوشیده شده و بیماران مبتلا در خون خودشان تجمع زیادی از این پروتئین را دارند. بالکول کردن ژنوم HBV در تلاشهای اولیه به باکتری اشعه کلی تولید پروتئین فوق با شکست روبرو شد، بنابراین محققین سعی کردند، عمل فوق را در مخمر انجام دهند.
*برای این منظور ژن HBS - Ag به داخل وکتور (حامل) بیان کننده با کپی زیاد از مخمر وارد شد. مخمرهای ترانسفوری شده با این پلاسمیر وکتور ، مقادیر زیادی از پروتیئن ویروسی فوق را تولید کردند. (حدود 2 - 1 درصد کل پروتئین مخمر). با کشت مخمر در مقیاس های بزرگ امکان تولید 100-50 میلی گرم از پروتئین فوق در هر لیتر کشت وجود دارد. پروتئین مخمری فوق حالا برای واکسیناسیون برضد عفونتهای هپاتیت B استفاده میگردد.
!مباحث مرتبط با عنوان
*((ژنتیک))
*((ژنتیک پایه))
*((کاربرد عملی مهندسی ژنتیک))
*((گیاهان و مهندسی ژنتیک))
*((مهندسی ژنتیک))
*((مهندسی ژنتیک در پستانداران))